NRPB07S Ni-IDA瓊脂糖凝膠FF預裝柱

相關介紹： 

鎳-瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為基質，通過活化偶聯亞氨基二乙酸（IDA），再螯合Ni²⁺。其中IDA是金屬螯合層析中最常用的配體，與次氮基三乙酸（NTA）相比，具有親和力強，載量高，可再生重復使用的特點。

鎳-瓊脂糖凝膠FF主要用于純化帶組氨酸標簽（His-Tag）的重組蛋白。純化原理是利用重組蛋白組氨酸標簽的咪唑環可與過渡金屬Ni²⁺形成穩定的配位鍵，因此能特異、牢固、可逆地吸附于固定這些金屬離子的基質，結合了His-Tag重組蛋白的鎳-瓊脂糖凝膠FF一般通過增加咪唑濃度進行競爭洗脫。

技術指標：

使用方法：

1.色譜柱裝填

1.1 所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一至，液體最好做脫氣處理。

1.2 在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣，關閉柱子出口，在柱內保留少量的蒸餾水。

1.3 將瓊脂糖凝膠連續倒入柱子時，要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產生，讓填料先自然沉降。

1.4 柱壓不超過0.3 MPa，如果裝柱系統中無法測柱壓，則控制流速高于300 cm/h，但是在使用中一般只用最大流速的75%。

1.5填裝好的鎳-瓊脂糖凝膠FF柱用2 ~ 5個柱體積的初始緩沖溶液平衡，建議流速100 cm/h，平衡后的柱子可以用于His-Tag重組蛋白的上樣和洗脫純化。

2.上樣

2.1 樣品一般溶解在pH6 ~ 8的初始緩沖液中，提高上樣緩沖液的pH值，可以增大載量。

2.2 緩沖液中不能含有EDTA和檸檬酸鹽，也最好不含巰基乙醇、DTT等還原劑。

2.3常用緩沖液有10 ~ 100 mM 磷酸鈉緩沖液、20 ~ 200 mM Tris-HCl緩沖液等。

2.4在緩沖液中一般要加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl，以消除離子交換作用。

2.5在初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF，推薦使用50 mM PBS（50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，NaOH調節pH 7.4）作為初始緩沖液。

3. 洗脫

3.1 鎳-瓊脂糖凝膠FF最常用的洗脫方法為增加咪唑濃度進行洗脫。

3.2咪唑為堿性，相應緩沖液配制后需要用HCl進行調節pH。

3.3在初次使用鎳-瓊脂糖凝膠FF，不知道洗脫的咪唑濃度，推薦在初始緩沖液中分別加入10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、200 mM、500 mM咪唑，濃度從低到高，分別洗脫和收集，通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定。

3.4 有條件的也可以進行線性咪唑梯度洗脫，確定較佳洗脫條件。

拓展應用：

1. 更換不同的螯合離子

1.1 IDA螯合的鎳-瓊脂糖凝膠FF可以用EDTA脫掉鎳，脫掉鎳后可以用0.1 ~ 1.0M NaOH進行清洗凝膠，再重新螯合鎳，使凝膠煥然一新。也可以螯合其他金屬離子，如Cu²⁺，Zn²⁺，Co²⁺，Fe³⁺等，進行多樣純化。

1.2 脫鎳方法：用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗柱子，再用5 ~ 10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2 ~ 3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

1.3螯合金屬離子方法：用2 ~ 5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳的柱子，用0.1 ~ 0.3M金屬鹽溶液過柱5 ~ 10個柱體積螯合金屬，螯合后用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗，去除未螯合的金屬離子。

1.4 金屬鹽可以為硫酸鹽或鹽酸鹽，如為NiSO₄、CuSO₄、ZnSO₄、CoCl₂、PbSO₄等，金屬鹽溶液應中性或弱酸性，且必須經過過濾，以防止金屬鹽在膠上沉淀。

1.5 如果是Fe³⁺必須在低pH下螯合（pH 3），以防止Fe³⁺產生沉淀，一般可以加入少量鹽酸和硫酸保持pH。

2. 多種洗脫方法

2.1 降低pH洗脫：大多數蛋白在pH 4 ~ 6會被洗脫下來，也可以在pH 3 ~ 4，緩沖液可以是醋酸鈉、檸檬酸或磷酸鹽緩沖體系。

2.2 競爭性洗脫：線性增加或一步增加與金屬離子有親和力的物質，如0 ~ 0.5 M咪唑，0 ~ 50 mM組氨酸，0 ~ 2 M NH4Cl。梯度洗脫最好在起始緩沖液的恒定pH下進行。

2.3 螯合劑洗脫：EDTA、EGTA等螯合劑會與金屬離子產生作用力，導致蛋白被洗脫下來。這種方法不能使不同的蛋白分離，此外會影響蛋白吸附，導致融合蛋白不能掛柱。

2.4 所有上述情況中，緩沖液中必須加入0.15 ~ 0.5 M的NaCl 以消除離子交換作用。

2.5 當螯合離子配基是Cu²⁺時，有以下的三種操作方式。

降低pH洗脫：

上樣緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脫緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 3.5

競爭性洗脫：

上樣緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NaCl，pH 7.4

洗脫緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，1 M NH4Cl，pH 7.4

螯合劑洗脫：

上樣緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，pH 7.4

洗脫緩沖液：50 mM NaH₂PO₄，0.5 M NaCl，50 mM EDTA，pH 7.4

注：配制的緩沖液需要用NaOH或HCl調節至要求的pH。使用降低pH和螯合劑洗脫會使金屬離子脫落，下次使用得重新螯和金屬離子，最常用的為競爭性洗脫。

再生、清洗：

1. 凝膠的再生

1.1 多次使用后或需要更換螯合的金屬離子，必須將膠脫鎳再生。脫鎳方法：用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗柱子，再用5 ~ 10個柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子，再用2 ~ 3個柱體積的0.5 M NaCl洗掉殘留的EDTA。

1.2 多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法：用0.1 ~ 1.0 M NaOH反向清洗柱子，流速50 cm/h，保持1 ~ 2 h，能去除結合強的雜質，同時也能去除熱源。

1.3 清洗后需要重新螯合金屬離子。螯合方法：用2 ~ 5個柱體積的蒸餾水充分平衡脫鎳的柱子，用0.1 ~ 0.3M金屬鹽溶液過柱5 ~ 10個柱體積螯合金屬，螯合后用5 ~ 10個柱體積蒸餾水淋洗，去除未螯合的金屬離子。

2.在位清洗

2.1 除去因離子交換作用吸附的蛋白，用2 ~ 3個柱體積2 M 的NaCl溶液反向清洗柱子。

2.2 除去強的疏水性蛋白和脂質等，用4個柱體積的70%的乙醇或者30%的異丙醇反向清洗柱子。

2.3 除去蛋白沉淀、疏水性蛋白，參照凝膠的再生。

注意事項：

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