NRPB76 IMAC瓊脂糖凝膠FF

相關介紹： 

　　螯合金屬離子親和層析（IMAC）瓊脂糖凝膠FF具有螯合金屬離子的能力，如螯合Cu2+、Zn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+等，螯合金屬離子后可用于富含組氨酸、色氨酸、半胱氨酸的蛋白質純化，其中最常見的是用于融合了6-8個組氨酸標簽的蛋白質純化。與IDA瓊脂糖凝膠FF相比，IMAC瓊脂糖凝膠FF一般可以更牢固的結合金屬離子，在純化標簽蛋白方面，有可能獲得更高純度的樣品。

技術指標：

使用方法：

1、色譜柱裝填

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣，關閉柱子出口，在柱內保留少量的蒸餾水。

（3）將瓊脂糖凝膠連續倒入柱子時，要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產生，讓填料先自然沉降，建議柱床高度不超過20cm。

（4）柱壓不超過0.3MPa，如果裝柱系統中無法測柱壓，則正常使用流速填裝。

（5）填裝好的IMAC瓊脂糖凝膠FF柱用5個柱體積蒸餾水清洗，使用的流速建議為100cm/h。

2 螯合金屬離子

（1）根據需要選擇金屬鹽，一般配置0.1-0.2M金屬鹽溶液，常見的有CuSO4、ZnSO4、NiSO4、CoCl2等。注意金屬鹽溶液的pH以偏酸性為宜（如pH4-6，Fe3+一般需要pH3），防止在螯合時pH上升產生沉淀。

（2）蒸餾水清洗后的IMAC瓊脂糖凝膠FF用1-3個柱體積金屬鹽溶液過柱螯合金屬離子，然后用5個柱體積以上的蒸餾水清洗層析柱，去除游離的金屬鹽溶液。

（3）用5個柱體積以上的乙酸緩沖液（20mM 乙酸-乙酸鈉，1M 氯化鈉，pH4.0）清洗，去除結合不牢固的金屬離子，減少在使用過程的脫落。

（4）處理完后可用結合緩沖液平衡層析柱，用于目標蛋白的純化。

3、純化目標蛋白

（1）選擇緩沖液：一般選用pH6-8的結合緩沖液，常用緩沖液有10-00mM 磷酸鈉緩沖液、20-200mM Tris-HCl緩沖液等。在緩沖液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除離子交換作用。在初次使用IMAC瓊脂糖凝膠FF，推薦使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH調節pH 7.4）作為結合緩沖液。

（2）樣品處理：樣品的緩沖液應與所選結合緩沖液一致。為保證緩沖液一致，可以在結合緩沖液中破碎細菌、或調解pH與結合緩沖液一致、或交換至結合緩沖液（常用方法有透析、超濾、脫鹽柱換液等）、或用結合緩沖液稀釋2-10倍等。樣品上柱前應0.45μm過濾。

（3）平衡上樣：螯合金屬離子的IMAC瓊脂糖凝膠FF用結合緩沖液平衡5個柱體積，然后將樣品上柱，上完樣后，用結合緩沖液平衡。

（4）洗脫優化：螯合金屬離子的IMAC瓊脂糖凝膠FF最常用的洗脫方法為增加咪唑濃度進行洗脫。初次實驗不知道洗脫的咪唑濃度，可嘗試不同的濃度洗脫，建議在結合緩沖液中分別加入5mM、10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑（咪唑為堿性物質，加入咪唑后需重新調節pH），濃度從低到高，先后分別洗脫和收集，通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫組份。

4、再生清洗

（1）多次使用后或需要更換螯合的金屬離子，必須將凝膠脫去金屬離子再生。脫金屬離子方法：用5-10個柱體積蒸餾水淋洗柱子，再用10個以上柱體積的100 mM EDTA淋洗柱子，再用3-5個柱體積的0.5M NaCl洗掉殘留的EDTA。

（2）多次使用的柱子脫鎳后一般需要清洗。清洗方法：用0.1-1.0M NaOH反向清洗柱子，流速50cm/h，保持1-2h，能去除結合強的雜質，同時也能去除熱源。NaOH清洗后應立即用5個柱體積以上的蒸餾水清洗至中性，清洗后可按照螯合金屬離子的方法重新螯合金屬離子。

5、保存

IMAC瓊脂糖凝膠FF和螯合金屬離子后的IMAC瓊脂糖凝膠FF都可以用20%乙醇保存，一般蒸餾水清洗后，用3個柱體積20%乙醇清洗。20%乙醇清洗后的層析柱和凝膠可放置在2-25℃條件下保存。