NRPB57L Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF

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Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF以瓊脂糖微球為基質，通過活化偶聯次氮基三乙酸（NTA），再螯合Ni²⁺。與亞氨基二乙酸（IDA）相比，具有更好的螯合劑、還原劑、堿性的耐受性，如樣品中含有1-10mM EDTA或1-10mM β-巰基乙醇或5mM DTT，可正常純化；在螯合鎳的情況下，也可以用0.1M NaOH清洗。

Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF主要用于純化帶組氨酸標簽（His-Tag）的重組蛋白。純化原理是利用重組蛋白組氨酸標簽的咪唑環可與過渡金屬Ni²⁺形成穩定的配位鍵，因此能特異、牢固、可逆地吸附于固定這些金屬離子的基質，結合了His-Tag重組蛋白的Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF一般通過增加咪唑濃度進行競爭洗脫。

技術指標：

使用方法：

1、色譜柱裝填

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）在柱子下端加入蒸餾水，以除去柱子中的空氣，關閉柱子出口，在柱內保留少量的蒸餾水。

（3）將瓊脂糖凝膠連續倒入柱子時，要用玻璃棒的緊靠柱子內壁引流，以減少氣泡的產生，讓填料先自然沉降。

（4）柱壓不超過0.3MPa，如果裝柱系統中無法測柱壓，則正常流速下填裝。

（5）填裝好的Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF柱用2-5個柱體積的初始緩沖溶液平衡，建議流速100cm/h，平衡后的柱子可以用于His-Tag重組蛋白的上樣和洗脫純化。

2、上樣

（1）緩沖液選擇：一般選用pH6-8的結合緩沖液，常用緩沖液有10-00mM 磷酸鈉緩沖液、20-200mM Tris-HCl緩沖液等。在緩沖液中一般要加入0.15-0.5M的NaCl，以消除離子交換作用。在初次使用Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF，推薦使用50mM PBS（50 mM NaH2PO4，0.5M NaCl，NaOH調節pH 7.4）作為結合緩沖液。

（2）樣品處理：樣品的緩沖液應與所選結合緩沖液一致。為保證緩沖液一致，可以在結合緩沖液中破碎細菌、或調解pH與結合緩沖液一致、或交換至結合緩沖液（常用方法有透析、超濾、脫鹽柱換液等）、或用結合緩沖液稀釋2-10倍等。樣品上柱前應0.45μm過濾。

3、洗脫

（1）Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF最常用的洗脫方法為增加咪唑濃度進行洗脫。

（2）咪唑為堿性，相應緩沖液配制后需要用HCl進行調節pH。

（3）在初次使用Ni-NTA瓊脂糖凝膠FF，不知道洗脫的咪唑濃度，建議在結合緩沖液中分別加入10mM、20mM、50mM、100mM、200mM、500mM咪唑，濃度從低到高，分別洗脫和收集，通過SDS-PAGE電泳等方法鑒定洗脫組份。

（4）有條件的也可以進行線性咪唑梯度洗脫，確定較佳洗脫條件。

4、在位清洗

在多次使用后需要在位清洗，常用方法為先5個柱體積蒸餾水清洗，再用1-3個柱體積50mM NaOH清洗10-20min，立即用5個柱體積結合緩沖液（50mM PBS）清洗平衡。

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